本发明涉及一种检测凝血酶的电化学发光传感器的制备方法及应用，将带有活性基团的联吡啶钌修饰到金纳米粒子表面形成电化学发光纳米粒子探针，对电化学发光起放大作用，在工作电极表面上修饰上部分DNA单链，组成电化学发光传感器。将目标分析物凝血酶与部分DNA双链作用，再与DNA聚合酶和Nb.BbvCI切口酶、部分DNA单链作用，得DNA杂交液，将其加到传感器中，使得电极表面电化学发光纳米粒子探针增加，导致电化学发光信号增强，以此现象实现对凝血酶的测定。本发明的传感器具有很高的选择性和检测灵敏度。